Геномните последователности на повечето вируси са известни.Нуклеинови киселинни сонди, които са къси сегменти от ДНК, предназначени да хибридизират с комплементарни вирусни ДНК или РНК сегменти.Полимеразната верижна реакция (PCR) е по-ефективна техника за откриване на вируси.Наскоро бяха разработени диагностични методи с висока производителност.
А. Техника на хибридизация на нуклеинова киселина
Хибридизацията на нуклеинова киселина, включваща главно Southern blotting (Southern) и Northern blotting (Northern), е бързо развиваща се нова техника в областта на диагностиката на вируси.Обосновката на хибридизационния анализ е да се използват къси сегменти от ДНК (наречени „сонда“), предназначени да хибридизират с комплементарни вирусни ДНК или РНК сегменти.Чрез нагряване или алкална обработка, двойноверижната целева ДНК или РНК се разделят на единични вериги и след това се имобилизират върху твърда подложка.След това се добавя сонда и се хибридизира с целевата ДНК или РНК.Тъй като сондата е белязана с изотоп или нерадиоактивен нуклид, целевата ДНК или РНК може да бъде открита чрез авторадиография или чрез системата биотин-авидин.Тъй като повечето от вирусните геноми са клонирани и секвенирани, те могат да бъдат открити с помощта на специфични за вируса последователности като сонди в пробата.Понастоящем методите за хибридизация включват: дот блот, in situ хибридизация в клетки, ДНК блот (ДНК) (Southern blot) и РНК блот (RNA) (Northern blot).
B.PCR технология
През последните години бяха разработени серия от in vitro техники за амплификация на нуклеинова киселина, базирани на PCR, за тестване на нечувствителни или некултивирани вируси.PCR е метод, който може да синтезира специфична ДНК последователност чрез in vitro полимеразна реакция.Процесът на PCR включва термичен цикъл от три стъпки: денатурация, отгряване и удължаване. При висока температура (93℃~95℃), двойноверижната ДНК се разделя на две единични ДНК вериги;след това при ниска температура (37℃~60℃), два синтезирани нуклеотидни праймера се свързват с комплементарните ДНК сегменти;като има предвид, че при подходяща температура за ензима Taq (72 ℃), синтезът на нови ДНК вериги започва от 3'-края на праймера, използвайки комплементарна ДНК като шаблони и единични нуклеотиди като материали.Така че след всеки цикъл една ДНК верига може да бъде амплифицирана в две вериги.Повтаряйки този процес, всяка ДНК верига, синтезирана в един цикъл, може да се използва като шаблон в следващия цикъл и броят на ДНК веригите се удвоява във всеки цикъл, което означава, че производството на PCR се усилва с 2n log скорост.След 25 до 30 цикъла, производството на PCR се идентифицира чрез електрофореза и специфичните ДНК продукти могат да се наблюдават под UV светлина (254 nm).Поради своето предимство на специфичност, чувствителност и удобство, PCR е възприет в клиничната диагностика на много вирусни инфекции като HCV, HIV, CMV и HPV.Тъй като PCR е много чувствителен, той може да открие вирусна ДНК на ниво fg, операцията трябва да се извърши много внимателно, за да се избегнат фалшиви положителни резултати.В допълнение, положителният резултат от теста за нуклеинова киселина не означава, че в пробата има жив инфекциозен вирус.
С широкото приложение на PCR техниката се разработват нови техники и методи, базирани на PCR техника за различни тестови цели.Например, количествената PCR в реално време може да открие вирусен товар;in situ PCR се използва за идентифициране на вирусна инфекция в тъкан или клетки;Вложената PCR може да увеличи специфичността на PCR.Сред тях количествената PCR в реално време е разработена по-бързо.Много нови техники, като сонда за хидролиза TaqMan, сонда за хибридизация и сонда за молекулярни маяци, са комбинирани в количествена PCR техника в реално време, която се използва широко в клиничните изследвания.Освен точното идентифициране на вирусния товар в телесните течности на пациентите, този метод може да се използва и за откриване на толерантен към лекарства мутант.Следователно, количествената PCR в реално време се прилага главно при оценка на лечебния ефект и наблюдение на лекарствената толерантност.
C. Високопроизводително откриване на вирусни нуклеинови киселини
За да се отговори на нуждите от бърза диагностика на нови възникващи инфекциозни заболявания, са създадени различни високопроизводителни методи за откриване, като ДНК чипове (ДНК).За ДНК чипове се синтезират специфични сонди и се прикрепят към малки силициеви чипове с много висока плътност, за да се образува микрочип на ДНК сонда (ДНК), който може да се хибридизира с проба.Сигналът на хибридизацията може да бъде изобразен с конфокален микроскоп или лазерен скенер и да бъде допълнително обработен от компютър и може да се получи огромен набор от данни относно различни гени.Има два вида ДНК чипове.„Чипът за синтез“ е следният: специфичните олигонуклеотиди се синтезират директно върху чиповете.Друг е ДНК пул чип.Клонираните гени или PCR продуктите са подредени отпечатани върху слайда.Предимството на технологията с ДНК чипове е едновременното откриване на огромно количество ДНК последователности.Най-новата версия на чип за откриване на патогени може да идентифицира над 1700 човешки вируса наведнъж.Технологията на ДНК чипове реши проблемите на традиционните методи за хибридизация на нуклеинови киселини и има много широко приложение при вирусна диагностика и епидемиологично изследване.
Време за публикуване: 23 декември 2020 г